質粒大量抽提操作過程及技巧詳解
閱讀次數：340 發布時間：2024/8/16 9:58:35
1. 取過夜菌至50毫升離心管內，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重復一次，每管共收集100毫升過夜菌沉淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約50毫升菌液并重復上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復上述操作1-2次。對于高拷貝質粒所用菌量每管一般不能超過150毫升，對于低拷貝質粒所用菌量每管一般不能超過200毫升。過量的細菌會導致后續的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。
確認溶液I中已添加了RNase A。高速度vortex 10-20或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應呈均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開，或手指把沉淀彈開。
3. 每管加入5毫升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，室溫放置1-2分鐘，使細菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致終所得質粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細菌沒有完全散開，那么顛倒4-6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇到有少量團塊或絮狀物產生的情況，可以增加顛倒次數3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。
4. 每管加入7毫升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生。
切勿vortex！顛倒次數也不宜過多，否則易導致終所得質粒的質量下降。
5. 12,000-14,000rpm)室溫離心10分鐘。
如果離心機的高速度較低，需要適當延長離心時間，例如約5000-6000rpm時需要離心20-30分鐘或更長時間，直至沉淀充分。離心時可以準備好質粒純化柱，自制漏斗等，并在純化柱上標上記號。
6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內。12,000-14,000rpm離心2分鐘，倒棄收集管內液體。
質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。本步驟及后續需要12,000-14,000rpm離心2分鐘的步驟，如果離心機的高速度較低，需要適當延長離心時間，例如約5000-6000rpm時需要離心約5分鐘或更長時間，直至液體全部穿柱。如果離心后有少量漂浮物，可以考慮再次離心，或者使用擦鏡紙兩次對折后打開形成的自制漏斗，以過濾去除漂浮物。
7. 在質粒純化柱內加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm離心2分鐘，洗去雜質，倒棄收集管內液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。
8. 12,000-14,000rpm再次離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發。
注意：倒棄收集管內液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。
9. 將質粒純化柱置于50毫升離心管上，加入2毫升溶液V至管內柱面上，放置2分鐘。
也可以用重蒸水或MilliQ純水替代溶液V，但是水的pH應不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質粒產量會略有幫助。如想得到較高濃度的質粒，可以加入1毫升溶液V洗脫，質粒得率實測減少約5-10%，具體減少量與特定樣品有關。
10. 12,000-14,000rpm離心2分鐘，所得液體即為轉細胞超純質粒。
通常所得質粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右，可以用于細胞轉染。如果想得到高濃度的質粒，可以采用如下的異丙醇沉淀方法濃縮質粒或常規的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍體積的常溫異丙醇(例如1毫升待濃縮質粒中加入0.7毫升異丙醇)，混勻后1,2000-14,000rpm 4℃離心10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
如果希望獲得較高濃度的質粒，在洗脫時推薦采用1毫升洗脫液進行洗脫，后續可以轉移到2毫升離心管內進行異丙醇沉淀，這樣操作起來相對比較方便。異丙醇沉淀的DNA為玻璃狀近透明的顆粒狀沉淀，和乙醇沉淀產生的含鹽沉淀物相比較難觀察清楚。離心后取放離心管要盡量輕柔，避免沉淀松動或部分顆粒狀懸浮至溶液中。不推薦直接倒棄上清，直接倒棄上清時經常出現直接把質粒沉淀倒掉的情況；如果偏好直接倒棄上清，建議把上清倒棄至一潔凈離心管內，這樣萬一沉淀被倒出，仍然可以從潔凈離心管中回收。推薦用移液槍吸去上清，并注意盡量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常溫70%乙醇溶液，輕輕懸起質粒沉淀以充分洗滌，12,000-14,000rpm 4℃離心5-10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃離心5-10，用20微升或200微升移液器小心吸凈殘留液體，避免觸及沉淀。
d. 肉眼觀察無明顯液體后(吸凈液體后通常在1分鐘內即可完成干燥)，加入適當體積的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q純水)溶解DNA。
DNA樣品不能過于干燥，否則很難溶解。好在弱堿性條件下溶解DNA，溶解時可用緩沖液反復沖洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。
附表1. EndA- ａnd EndA+ strains of E. coli.
EndA- EndA+
BJ5183 BL21(DE3)
DH1 CJ236
DH20 HB101
DH21 JM83
DH5α JM101
JM103 JM110
JM105 LE392
JM106 MC1061
JM107 NM522 (all NM series are EndA+)
JM108 NM554
JM109 P2392
MM294 PR700 (all PR series are EndA+)
SK1590 Q358
SK1592 RR1
SK2267 TB1
SRB TG1
0 Y1088 (all Y10 series are EndA+)
XL1-Blue BMH 71-18
XLO ES1301
客服一
