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甘油菌種復蘇保存涉及幾個關鍵步驟，‌包括菌種的保存、‌復蘇以及再次保存的過程。‌以下是詳細的步驟和注意事項：‌

菌種保存：‌

將菌種接種于LB液體培養基，‌并在對數生長期時，‌當培養體系內渾濁可見時，‌進行保存。‌

準備50%濃度的甘油溶液，‌可以通過等體積的蒸餾水和甘油混合得到。‌

在無菌條件下，‌將菌液與50%濃度的甘油按1:1的比例混合，‌使甘油終濃度達到25%。‌

將混合液轉移至2ml離心管中，‌并在-20°C冰箱內保存。‌這種條件下，‌菌種的保存有效期為1年。‌若需長期保存，‌建議在-70°C或-80°C下凍存，‌保藏時間一般為2-4年左右12。‌

菌種復蘇：‌

在使用，‌將保存的菌種在30°C水浴中解凍。‌

解凍后，‌將菌液接種到固體培養基上，‌并在適宜條件下培養24-48小時，‌以恢復菌種的活性。‌

再次保存：‌

復蘇后的菌種可以在新的液體培養基中繼續培養，‌并再次進行甘油保存。‌這一過程確保了菌種的長期保存和可用性。‌

注意事項：‌

確保所有使用的工具和容器都經過適當的滅菌處理，‌以避免污染。‌

在操作過程中保持無菌條件，‌以防止外界微生物的污染。‌

正確的保存和復蘇方法對于保持菌種的活性和純度至關重要。‌

保存的溫度對菌種的長期存活有很大影響，‌低溫條件有利于延長保存時間。