、核酸的純化
在分子克隆的所有操作中，zui基本的操作是核酸的純化。其關鍵步驟是去
蛋白質，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每當需要把克隆有某些所用的酶滅活或去除以便進行下步時，可進行這種抽提。然而，如要從細胞裂解液等復雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質后，再用有機溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等，它們對多種天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：這兩種有機溶劑合用，比單獨用酚抽提的除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚/氯仿。②旋渦混勻管內容物，使呈乳狀。③12000×g室溫離心15。④水相移入另離心管，棄去兩相界面和有機相。⑤重復步驟①－④步操作，直至兩相界面上見不到蛋白質為止⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。
二、核酸的濃縮
應用zui廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當的緩沖液中。
具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中15－30min，取出目測平衡，0－4度，12000g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當體積的緩沖液中。
單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強烈抑制劑。當用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應使用NaCl，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2 ）。
三、DNA、RNA的定量
準確的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸樣品是純凈的（即無顯著的蛋白質、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度計測定260nm和280nm兩個波長處的光吸收，然后，按IA260相當于50μg/ml雙鏈DNA。40μg/ml單鏈DNA或RNA及20μg/ml單鏈寡核苷酸。計算你的樣品含量。260nm和280nm兩處讀數的比值（A260/A280），可反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0如果樣品中有蛋白質或酚的污染，則A260/A280將明顯低于此值，此時就無法對樣品中的核酸進行精確定量。可將樣品純化后再作定量測定。有豐富實驗室經驗的人，僅憑樣品電泳后溴化乙錠染色螢光帶的強度，即可大致判斷出樣品中的核酸含量，故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。
客服一
