構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞株的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含抗性基因進行篩選，可得到穩(wěn)定表達目的
蛋白、或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株，即穩(wěn)轉(zhuǎn)株。
構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株主要有兩種方法：線性
質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染法和慢病毒感染法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受制于質(zhì)粒大小、轉(zhuǎn)染介質(zhì)的限制，對很多細胞轉(zhuǎn)染效率低，而且質(zhì)粒整合入細胞基因組的效率極低，所以構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的成功率不高。而慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞，并且在感染后容易整合到受感染細胞的基因組，進行長時間穩(wěn)定表達，因此，慢病毒是目前用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株*主流的方法。
構(gòu)建流程以及注意事項
1. 慢病毒載體構(gòu)建，過表達載體或者干擾載體構(gòu)建
慢病毒過表達載體有基因容量限制，對于大于5k的基因，包裝出慢病毒的概率很低，不建議包裝病毒。同時大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低，在做正式實驗之前，可用先-進行病毒的小量包裝，成功后再進行病毒大量包裝。對于敲低，通常的策略是對一個基因同時選擇3個干擾靶點，通過qPCR驗證干擾效率之后，使用效率好的靶點進行下一步實驗。
慢病毒載體帶有不同的標簽，如果研究細胞定位，可以選擇帶熒光標簽的慢病毒載體，比如帶GFP/RFP等；如果準備篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，可以選擇帶篩選標簽的慢病毒載體，比如puro/neo等載體；如果目的基因大小適中，也可以選擇同時帶熒光標簽和篩選標簽的載體。
2. 293T
細胞培養(yǎng)及慢病毒包裝
細胞的狀態(tài)對于病毒包裝有很大的影響，如果細胞狀態(tài)不好可能不出毒或者出毒量很低。取狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293T細胞進行慢病毒包裝。第三代四質(zhì)粒包裝質(zhì)粒配比，可以按照分子量來折算，并在附近量做實驗，摸索*適質(zhì)粒配比，以得到更高滴度的病毒。
3. 慢病毒滴度檢測及保存，使用熒光梯度稀釋法或者qPCR法檢測
慢病毒表達時間較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染后72小時后觀測熒光表達或者qPCR檢測。感染期間請根據(jù)細胞生長的情況對細胞進行及時換液，以保證細胞良好的生長狀態(tài)。值得考慮的是使用低濃度的血清來培養(yǎng)細胞，作用是抑制細胞增殖。
特別注意，慢病毒可以存放于-80℃6個月以上，但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前重新滴定病毒滴度。反復(fù)凍融會降低病毒滴度，每次凍融會降低病毒滴度10%，因此，在病毒使用過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，強烈建議收到病毒后按照每次的使用量將病毒進行分裝。
4. 目的細胞MOI值摸索，確定*適慢病毒感染復(fù)數(shù)
同一種細胞在不同實驗室中由于傳代次數(shù)、操作細節(jié)的不同，細胞狀態(tài)會有所差異，另一方面病毒液在運輸、保存過程中可能造成即時滴度的變化。因此為了達到*-佳的實驗效果，建議在正式實驗前進行3-4種不同MOI的感染預(yù)實驗。細胞匯合度對抗生素篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時細胞匯合度不宜超過50%。
5. 目的細胞藥物篩選濃度確定-通過梯度實驗
使用不同濃度的抗生素對細胞進行處理，選擇出在10-14天內(nèi)使細胞全部死亡的*-低抗生素濃度來進行下一步的篩選試驗。不同的細胞對于同一種抗生素，其篩選濃度不同，而同一種細胞對于不同的抗生素，其*-佳使用濃度也不同。所以在進行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選之前，一定要先-進行藥物濃度篩選預(yù)實驗以確定*-佳藥物篩選濃度。
6. 慢病毒感染目的細胞篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株
由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)，所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，*終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆。一般在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加抗生素記性篩選。加藥篩選后，死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有抗生素表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液。
7. 穩(wěn)轉(zhuǎn)株檢測
通過qPCR或者Western Blot檢測目的基因，需要注意的是，mRNA的表達水平可能和蛋白的表達水平不一致，如果需要進一步研究蛋白的功能，可以使用WB檢測蛋白的表達水平。
一般需要構(gòu)建穩(wěn)定株的情況如下：
1. 長期在目的細胞中研究基因功能，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也極-大方便實驗研究；
2. 部分蛋白半衰期極長，瞬時 RNA 只能干擾表達，無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實現(xiàn)更好的基因干擾效果；
3. 瞬轉(zhuǎn)往往會引入極高拷貝數(shù)的表達，導(dǎo)致因為人為因素造成實驗結(jié)果的不精-確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究；
4. 需要用誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時空表達的；
5. 需要用細胞做動物實驗的，比如裸鼠成瘤等，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株。
客服一
