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技術文獻

ELISA實驗顯性淡、靈敏度低怎么回事?
閱讀次數：548 發布時間：2020/6/2 14:47:50

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問題	序號	可能原因	解決方法
顯色淡，靈敏度偏低	1	試劑盒未充分平衡	試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）
	2	樣品不適合做ELISA檢測	樣品一般選擇培養上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優化檢測的條件（例如稀釋液的成分）
	3	酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥	防止板過于干燥
	4	包被抗體遭到破壞	操作溫和，移液槍不能碰到孔底
	5	樣本和抗體孵育條件不合適	按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。
	6	洗滌浸泡時間過長	按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間；
	7	偶聯HRP試劑污染	棄去試劑，重新配置
	8	錯誤的稀釋偶聯HRP試劑	棄去試劑，重新配置
	9	TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優化孵育時間	確定合適的孵育時間：人為判定-濃度的標準品出現深藍色；S4-5有淡藍色；機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65
	10	樣本濃度過高或存在基質效應	建議做不同稀釋倍數，確認樣本*佳稀釋倍數。
	11	酶標儀濾光片設置有問題或者波長選擇不對	確認儀器設置及選擇正確的波長檢測。
	12	酶標板不適合做ELISA	不能使用細胞培養板，建議使用ELISA專用高吸附力板子。
背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2）	1	洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留	洗液準確配制；充分洗滌，靜置15秒，徹底拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染。
	2	底物污染，未避光保存，出現顏色	棄去底物，重新配置
	3	樣品稀釋液污染	棄去稀釋液，重新配置
	4	吸頭重復使用，未洗凈或消毒不徹底	吸頭盡可能一次性使用
	5	不正確的孵育時間，溫度（尤其是底物孵育的時間）	*為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。完全按照說明書要求。
	6	偶聯抗體（streptavidin-HRP）濃度過高	按照說明書調整到*佳的濃度
	7	ELISA板子不正確的貯存	酶標板貯存于2-8 ℃；使用結合力低點的Elisa板
	8	沒有正確封閉	在標準品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間
	9	樣本溶血嚴重	建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴重溶血樣本會導致背景偏高。
重復性不佳，高CV值	1	樣品不均一	加樣前充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致；
	2	包被板表面遭到破壞	洗板加樣時盡量小心，避免破壞板的包被表面
	3	孔與孔之間的交叉污染	孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染；封板膜不能重復使用
	4	加樣量不一致	樣品稀釋前應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴
	5	邊緣效應（外周孔顯色較中心孔深）	孵育時盡量100 rpm旋轉混勻
	6	微量加樣不準確	保證微量加樣的準確性和均一性
	7	不正確的洗滌	洗液準確配制；充分洗滌，靜置15秒，確定每一步的洗滌
出現白板，陽性對照不顯色	1	顯色液變質	更換新的顯色液
	2	洗滌液配制有誤	請按說明書所示稀釋倍數配制
	3	未加酶結合物而認為已加入	注意不要漏加
	4	終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用	每次加液前均應看清標簽
	5	標準品稀釋方法錯誤/或標準品有問題	請按照說明書所示配置說明書，注意單位和稀釋倍數
	6	不同試劑盒或不同批號的試劑混用	建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。
不正常的標準曲線	1	錯誤的方法重懸標準品	加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分
	2	標準品稀釋錯誤	按照說明書要求稀釋標準品
	3	標準品污染	使用一次性的滅菌吸頭，標準品貯存于2-8 ℃
	4	錯誤的倍比稀釋步驟	按照說明書倍比稀釋標準品
	5	波長選擇錯誤	TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優于單波長。
	6	標準品混用	不同批號試劑勿混用
	7	試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標準品失活	盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫
	8	ELISA未終止而直接檢測450nm和620nm	TMB顯色需終止后檢測，否則會出現620nm比450nm讀數高的現象。（數值仍有梯度規律）
樣品或標準品OD超出正常范圍	1	錯誤的樣品或標準品的稀釋	完全按照說明書稀釋
	2	偶聯抗體濃度過高	按照說明書調整到*佳的濃度
	3	TMB底物孵育時間過長	調整到合適的孵育時間
	4	樣品或標準品污染	避免污染
	5	錯誤的孵育時間或溫度	完全按照說明書
	6	孵育時未加蓋導致溶液揮發和污染	貼封片或加蓋
標曲很好，但是樣本無法計算到數值	1	標曲選擇不合適	選擇*合適的標曲擬合；
	2	樣本含量很低，低于靈敏度無法被檢測到	嘗試濃縮樣本或使用高敏elisa試劑盒檢測
	3	樣本含量很高，超過標曲	建議進行預實驗摸索稀釋倍數，確保樣本OD值落在標曲范圍內
標曲高濃度間無明顯趨勢	1	如OD絕對值靠譜，但是僅無梯度，則顯色過度	TMB顯色體系中建議根據S1，S2顏色進行判斷，當S1，S2深藍色，有明顯梯度，S5有淡藍色時即可終止。
標曲高濃度間無明顯趨勢	2	僅作單波長檢測。	由于參考波長讀取非特異性檢測，如指紋、劃痕、水漬等，對結果也有影響。建議終結果以雙波長為準確。