miRNA是大有希望的生物標志物，但精確檢測和定量并不是一件易事。為此，捷克的研究人員近日評估了三種miRNA檢測技術，比較了它們的定量偏倚、一致性和穩健性。他們在本期《BioTechniques》雜志上發表了分析結果。
目前，研究人員已經開發出多種方法來檢測miRNA，包括RNA測序、芯片和RT-qPCR。測序法和芯片法的優勢分別在于發現新穎的miRNA，或尋找與疾病相關的差異表達miRNA，適合高通量的miRNA分析，但不適合常規使用。對診斷領域而言，*具潛力的方法仍是金標準的RT-qPCR。
RT-qPCR方法大家都很熟悉，通常是先將成熟的miRNA轉化成cDNA序列，然后利用qPCR進行擴增。這種技術可以在標準的設備上自動化開展，因此如今已被廣泛使用。qPCR方法的靈敏度、特異性和重復性都是非常好的，但整個過程中*容易出錯的步驟是逆轉錄（RT）反應。
不過，*近又涌現出一些檢測miRNA的新穎方法。種方法稱為SplintR-qPCR，它保留了qPCR檢測過程，但改變了cDNA合成的過程。這種方法利用SplintR連接酶將與miRNA互補的探針A和探針B相連接，以取代RT過程。由于DNA探針與miRNA之間只需要4-6 bp的重疊，故在設計探針時具有更大的靈活性。
第二種方法是基于免疫分析的miRNA定量方法——miREIA。此方案是利用DNA探針與miRNA靶點進行雜交，然后再利用獨特的單克隆
抗體對DNA/RNA雜交體進行定量。它的檢測原理與ELISA相似，使用常規ELISA設備，便于臨床實驗室開展。整個過程不涉及到RT或擴增。
在此，研究人員比較了這三種檢測方法在臨床應用中的表現。他們利用賽默飛的TaqMan miRNA assay或TaqMan Advanced assay開展RT-qPCR；或利用NEB的SplintR連接酶按照文獻中的方案開展SplintR-qPCR；或采用BioVendor的miREIA方案進行檢測。他們檢測了30個樣本中miR-142-5p、miR-23a-3p和miR-93-5p的濃度。
研究人員發現繞開RT過程的方法所測得的濃度具有一致性，而RT-qPCR方法測得的濃度有三個對數的偏移，即測出的濃度大約高了1000倍。他們推測，可能的原因在于RT步驟本身。miRNA分子的長度僅為19-23個核苷酸，且序列非常相似，這就使得RT的引物設計非常復雜。
之后，他們又評估了這三種檢測方法的穩健性。結果表明，miREIA技術的穩健性*佳，對于全血和PBMC樣品，變異系數（CV）分別為17%和8%。SplintR-qPCR的結果很相似，CV分別為19%和16%。不過，RT-qPCR方法的穩健性*差，CV分別為39%和50%。
基于此，研究人員認為繞開RT過程的miRNA檢測方法更適合臨床應用。不過，RT-qPCR仍然是*靈敏的方法，在miRNA測定中無疑將占有一席之地。同時，SplintR-qPCR和miREIA方法更加穩健，絕對定量更精準。它們適用于以組織和全血為樣本的臨床實驗室，但在靈敏度方法還需要進行一些開發工作。
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
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