ChIP是一種強大的確定蛋白或者組蛋白修飾在基因組上定位的實驗方法。染色質被分離出來后采用抗體與抗原的結合來判定目的蛋白是否結合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白結合位點在全基因組范圍的分布（微陣列或DNA序列）。這種方法具有空間性與時效性。該實驗設計為如何在細胞中進行ChIP實驗提供了詳細的步驟。
1. 交聯和細胞收獲
甲醛可以將蛋白質交聯到DNA上。交聯結果的好壞決定于交聯時間的把握。我們建議樣品交聯的時間一般為2-30分鐘。過度的交聯會減少抗原的結合性和超聲斷裂的效率。抗原決定簇也會被掩蓋。加入甘氨酸可以消除甲醛使交聯反應終止。
1.1.準備兩個長滿細胞的150cm2的細胞培養皿（1*107-5*107 個細胞/皿）。將甲醛直接滴入PBS洗過的細胞培養皿中，使其終濃度為0.75%，然后在室溫緩慢旋轉10分鐘，使蛋白和DNA發生交聯。
1.2 加入甘氨酸使其終濃度為125mM,在室溫晃動孵育5分鐘。
1.3 使用10ml預冷PBS清洗細胞2次
1.4 使用細胞刮將細胞收獲放入 5ml 預冷PBS中，并轉入50ml的管子。
1.5.在皿里加入3mlPBS，將剩余的細胞轉移到50ml管子里1000g 離心5分鐘
1.6.將上清倒去，使用FA裂解液將沉淀重懸浮（1x107cells/750μl).
初始細胞要有1*107-5*107個，采用終濃度為0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸處理。預冷PBS洗3次，1，000g離心5分鐘，沉淀用FA裂解液重懸浮。
2 超聲破碎
超聲裂解細胞懸液可以將DNA均一的打斷成500-1000bp的片段。不同的細胞系需要不同的超聲時間才能達到*優效果。
交聯細胞要通過時間梯度的超聲來選擇*優超聲條件。樣品通過時間梯度，DNA的分離如部分3所描述。片段大小序在1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測分析。如圖一所示
圖一：
2.2 超聲破碎后，8000g，30秒，4°C,離心。將上清移入新的管子中。開始準備進行染色質免疫共沉淀（IP）。
2.3 每份超聲樣品取50ul，這時的樣品標記為INPUT，用于定量DNA濃度和作為PCR的空白對照。
超聲后的染色質應立刻凍入液氮中或者儲存于-70°C可儲存2個月。避免多次反復凍融。
3檢測DNA濃度1INPUT樣品用于為后來的IP樣品計算DNA濃度。DNA可采用PCR純化
試劑盒（加入70ul洗脫液，接著進入3.2a）或者采用酚/氯仿抽提（加入350ul洗脫液，接著按照3.2b進行）2a.加入2ulRNaseA(0.5mg/ml).加熱至65°C搖晃4-5小時或者過夜以逆轉交聯。DNA采用PCR純化試劑盒中廠家說明進行純化。樣品凍存于-20°C.
樣品之所以加入RnaseA是因為高濃度RNA會在使用PCR純化試劑盒時干擾DNA的純化。而純化柱子的飽和度是既定的。
2b.加入5ul蛋白酶K(20mg/ml).加熱至65°C搖晃4-5小時或者過夜以逆轉交聯。采用酚/氯仿抽提的DNA使用乙醇沉淀于10ul的糖原(5mg/ml).中。100ul水重懸浮。樣品凍存于-20°C.
樣品采用蛋白酶K處理可使相鄰肽段剪切成羧基團的芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸。蛋白質和DNA之間的交聯通過DNA的純化被打斷。
3檢測DNA濃度，取5ul純化的DNA到995ulTE中得到一個原
溶液的200倍稀釋測其OD260。
那么DNA的濃度就為OD260x10,000.μg/ml。這樣就可計算出染色質制品的DNA濃度。
4 免疫共沉淀1 從2.2得來的染色質制品，推薦每個IP樣品都采用25ug的DNA的量。每個樣品按1：10的量加入RIPA溶液。需要一個樣本作為空珠子的對照。
2在除空珠子對照樣品外每個樣品中加入一抗，抗體的量按照以往經驗來加，1-10ug的抗體/25ugDNA效果較好。
3加入20ul的proteinA/G珠子（預先用超聲處理成為單鏈的鯡精DNA和BSA吸附，詳見步驟4.3a）到所有樣品總，4°C搖轉IP過夜。
3a將蛋白A/G珠子與單鏈鯡精DNA進行預處理。如果同時使用蛋白A珠子和蛋白G珠子，等體積混合這兩種珠子使用RIPA溶液洗3次。除去RIPA溶液，加入單鏈鯡精DNA到珠子終濃度為75ng/μl，再用BSA將珠子終濃度定到0.1μg/μl。加入兩倍珠子體積的RIPA溶液在室溫孵育30分鐘。用RIPA洗一次，然后加入同體積的RIPA。
蛋白A珠子，蛋白G珠子或者它們的混合都可以使用。表格1顯示了蛋白A和蛋白G珠子對于不同免疫球蛋白同型的親和力。
4. 2000g，1分鐘離心蛋白A/G珠子，移除上清
5用1ml的WashBuffer溶液清洗珠子3次，2，000g，1分鐘離心，移除上清6用1ml的FinalWashBuffer溶液清洗珠子1次，2，000g，1分鐘離心，移除上清如果觀察到背景很高可以增加清洗次數，另外，超聲處理后的染色質也可以在步驟4.2以前采用蛋白A/G珠子孵育1小時。任何非特異吸附都可以通過這附加的一步清除掉。將上清（聲處理的染色質）倒入一個新的管子中按照步驟4.2使用抗體和珠子。
5. 洗脫和逆轉交聯1. 使用120ulElutionBuffer洗脫液加入蛋白A/G珠子中30°C搖晃15分鐘洗脫DNA。
2. 2000g，1分鐘離心，將上清移入新的管子中。此時的樣品可以凍存于-20°C3DNA可采用PCR純化試劑盒（步驟3.2a）或者酚/氯仿沉淀（加入280ul洗脫液，步驟見3.2b）4DNA的數量水平可通過定量PCR來檢測，引物和探針通常可以使用定量PCR儀上的軟件設計，或者使用在線設計軟件也可。
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
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