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遠慕詳述：蛋白質及氨基酸的呈色反應
閱讀次數：1994 發布時間：2016/12/1 16:07:19

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——以下由上海遠慕生物提供，僅作為參考！

標題:蛋白質及氨基酸的呈色反應
摘要: [蛋白質及氨基酸的呈色反應]實驗三蛋白質及氨基酸的呈色反應一、目的：1．了解構成蛋白質的基本結構單位及主要連接方式。2．了解蛋白質和某些氨基酸的呈色反應原理。3．學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法。二、呈色反應：（一）雙縮脲反應1．原理：素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環境中能與Cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱…… [關鍵詞:蛋白質氨基酸茚三酮反應呈色反應雙縮脲反應茚三酮尿素]……
關鍵詞: 蛋白質氨基酸茚三酮反應呈色反應雙縮脲反應茚三酮尿素

蛋白質及氨基酸的呈色反應
（一）雙縮脲反應
1．原理：
素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環境中能與Cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發生此反應。可用于蛋白質的定性或定量測定。
反應式見（p125）：
雙縮脲反應不僅為含有兩個以上肽鍵的物質所有。含有一個肽鍵和一個—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基團
NH2 NH2
的物質以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物質也有此反應。NH3也干擾此反應，因為NH3與Cu2+可生成暗藍色的絡離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。

2．試劑：
①尿素 ②10%氫氧化鈉溶液
③1%硫酸銅溶液 ④2%卵清蛋白溶液

3．操作：
取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。
向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液約2ml，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現。

（二）茚三酮反應
1．原理
除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有α—氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。
β—丙氨酸、氨和許多一級胺都呈陽性反應。尿素、馬尿酸、二酮吡唪和肽鍵上的亞氨基不呈現此反應。因此，雖然蛋白質和氨基酸均有茚三酮反應，但能與茚三酮呈陽性反應的不一定就是蛋白質或氨基酸。在定性、定量測定中，應嚴防干擾物存在。
該反應十分靈敏，1∶1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應，是一種常用的氨基酸定量測定方法。
茚三酮反應分為兩步，步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質。
反應機理見p127：
此反應的適宜pH為5~7，同一濃度的蛋白質或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。

2．試劑：
①蛋白質溶液
2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）
②0.5%甘氨酸溶液
③0.1%茚三酮水溶液
④0.1%茚三酮-乙醇溶液

3．操作：
①取2支試管分別加入蛋白質溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1~2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍。
②在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現。

（三）黃色反應
1．原理：
含有苯環結構的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質，該化合物在堿性溶液中進一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。反應式見p129：
多數蛋白質分子含有帶苯環的氨基酸，所以有黃色反應，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應。

2．試劑：
①雞蛋清溶液
將新鮮雞蛋的蛋清與水按1∶9混勻，然后用6層紗布過濾。
②大豆提取液
將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀再用紗布過濾。
③頭發 ④指甲
⑤0.5%苯酚溶液 ⑥濃硝酸
⑦0.3%色氨酸溶液 ⑧0.3%酪氨酸溶液
⑨10%氫氧化鈉溶液

3．操作：
向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現的現象，有的試管反應慢可略放置或用微火加熱。待各管出現黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。

（四）考馬斯亮藍反應
1．原理：
考馬斯亮藍G250具有紅色和藍色兩種色調。在酸性溶液中，其以游離態存在呈棕紅色；當它與蛋白質通過疏水作用結合后變為藍色。
它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應速度快，約在2分鐘左右時間達到平衡，在室溫一小時內穩定。在0.01~1.0mg蛋白質范圍內，蛋白質濃度A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質含量。

2．試劑：
①蛋白質溶液（雞蛋清∶水=1∶９）
②考馬斯亮藍染液
考馬斯亮藍G250100g溶于50 ml95%乙醇中，加100 ml85%磷酸混勻，配成原液。臨用前取原液15 ml，加蒸餾水至100 ml，用粗濾紙過濾后，*終濃度為0.01%。

3．操作：
取2支試管，按下表操作

原創作者：上海遠慕生物科技有限公司