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技術文獻

上海遠慕生物：MTT分析法
閱讀次數：717 發布時間：2016/10/11 10:53:31

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    MTT分析法

    原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產物(formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。

    實驗材料：細胞樣品試劑、試劑盒：PBSDMSO胰蛋白酶甘氨酸緩沖液儀器、耗材：加樣器96孔培養板酶聯免疫檢測儀培養板

    具體操作：普通MTT法1、接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2、培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天(可根據試驗目的和要求決定培養時間)。3、呈色：培養3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ulDMSO，脫色搖床振蕩10min，使結晶物充分融解。4、比色：選擇490nm(570nm)波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

    藥物MTT法貼壁細胞：1、收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度1000-10000孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。2、5%CO2，37℃孵育，至細胞貼壁，加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，一般是前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實況。3、5%CO2，37℃孵育24-72小時，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。5、終止培養，小心吸去孔內培養液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm(570nm)處測量各孔的吸光值。7、同時設置調零孔即空白組(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。

    懸浮細胞：1、收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640(無血清)培養基40ul；②加ActinomycinD(有毒性)10ul用培養液稀釋(儲存液100mg/ml，需預試尋找*稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100ml1640)。2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4h。(懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4h后可跳過步驟4)，直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)離心(1000轉x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定3復孔。

    注意事項：1、選擇適當得細胞接種濃度。

    2、避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。

    3、設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，*后比色以空白調零。

    4、MTT實驗吸光度*后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！

    5、吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3-4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面裝3-4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。

    6、吸管的吸液量在1ml左右：吸液量過多，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益。

    7、吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。

    8、吹打次數100左右，就可以吹打均勻了。

    9、向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則會使細胞聚積在底部。

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原創作者：上海遠慕生物科技有限公司