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技術文獻

遠慕生物分享---測培養細胞中污染的支原體
閱讀次數：697 發布時間：2016/9/26 11:17:10

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    遠慕生物分享－－-測培養細胞中污染的支原體

    PCR法
    原理該法是通過PCR技術將支原體16srRNA基因特異性擴增，來檢測培養細胞中污染的支原體。PCR引物選自16srRNA基因上的支原體特異片段，此片段與其他細菌的序列無交叉性雜交反應。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳，經溴乙啶（EB）染色后在紫外透射儀上進行檢測。

    u16srDNA引物用水稀釋至40umol/L。
    （1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
    （2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
    2）PCR擴增
    （1）在冰浴中對各樣品制備PCR重要混合物，對每個樣品均加入：
    10XPCR緩沖液5.0ml
    25mmol/LdNTPs混合物0.4ul
    40umol/L16srDNA引物每種引物1.0ul
    40umol/LpBR322DNA引物每種2.0ul
    pBR322DNA1pg/ml2.0ul
    DNA聚合酶（5U/ml）0.2ul
    三蒸水35.4ul
    總量45ul

    （2）用無菌去離子水稀釋樣品為1:10，1:100。
    （3）于每個eppendorf管中加45ulPCR擴增混合物，每管中分別加入樣品原液及1:10，1:100稀釋液各5ul，操作均在冰浴中進行。
    （4）在每個eppendorf管中輕輕加入50ul無菌礦物油，覆蓋在液面上。如DNA擴增儀帶有有制式熱蓋，此步驟可省略。
    （5）將各管放入DNA擴增儀的孔槽內，并執行以下循環指令：
    ①950C10min一個循環
    ②950C，30S→580C1min→720C1min,共30個循環。
    ③*后720C10min延長循環。

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原創作者：上海遠慕生物科技有限公司