色譜定量分析，顧名思義就是色譜分析方法來測定組分的含量，主要分為面積百分比法、歸一化法、外標法、內(nèi)標法和標準加入法，色譜定量分析先需要明確的概念是響應因子，不同的化合物在檢測器的響應是不一樣的，簡單地舉個例子說，相同濃度的化合物A和B，相同的進樣量，得到的峰高和峰面積不一定一樣的，響應因子的計算式如下：式中，w為化合物的含量，A為響應值，一般為峰面積或峰高，以峰面積為例。由于不同的化合物在同一個檢測器的響應因子不同，甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應因子不同，簡單地說就是化合物在檢測器的響應不呈線性，或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時，除需要考慮是相對定量還是絕對定量外，同時需要考察化合物的線性響應范圍、是否有合適內(nèi)標、是否有標準品等。接下來小編就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法：面積歸一化法、外標法和內(nèi)標法。歸一化法由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號，得到相應的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。若樣品中各組分的校正因子相近，可將校正因子消去，直接用峰面積歸一化進行計算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質及雜質的總量限度。優(yōu)/缺點優(yōu)點：簡便、準確、定量結果與進樣量重復性無關(在色譜柱不超載的范圍內(nèi))、操作條件略有變化時對結果影響較小。缺點：必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都流出/色譜柱，而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適于微量雜質的含量測定。外標法用待測組分的純品作對照物質，以對照物質和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。工作曲線法是用對照物質配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完/全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法)定量。外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：Wi＝AiWs／As式中Wi與Ai分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應的峰面積。Ws及As分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應峰面積。優(yōu)/缺點優(yōu)點：簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。缺點：此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。內(nèi)標法選擇樣品中不含有的純物質作為對照物質加入待測樣品溶液中，以待測組分和對照物質的響應信號對比，測定待測組分含量的方法稱為內(nèi)標法。“內(nèi)標”的由來是因為標準(對照)物質加入到樣品中，有別于外標法。該對照物質稱為內(nèi)標物。在一個分析周期內(nèi)不是所有組分都能流出/色譜柱(如有難氣化組分)，或檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號，或只需測定混合物中某幾個組分的含量時，可采用內(nèi)標法。準確稱量W克樣品，再準確稱量Ws克內(nèi)標物，加入至樣品中，混勻，進樣。測量待測組分i的峰面積Ai及內(nèi)標物的峰面積As，則i組分在W克樣品中所含的重量Wi，與內(nèi)標物的重量Wi，有下述關系：待測組分i在樣品中的百分含量Ci％為：對內(nèi)標物的要求：①內(nèi)標物是原樣品中不含有的組分，否則會使峰重疊而無法準確測量內(nèi)標物的峰面積；②內(nèi)標物的保留時間應與待測組分相近，但彼此能完/全分離(R≥1.5)；③內(nèi)標物必須是純度合乎要求的純物質。優(yōu)/缺點優(yōu)點：①在進樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內(nèi)，定量結果與進樣量的重復性無關。②只要被測組分及內(nèi)標物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關。③很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質的含量。由于雜質(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內(nèi)標法則很方便。缺點：加一個與雜質量相當?shù)膬?nèi)標物。加大進樣量突出雜質峰，測定雜質峰與內(nèi)標峰面積之比，即可求出雜質含量。但樣品配制比較麻煩和內(nèi)標物不易找尋。峰面積百分比法峰面積百分比法也是相對定量，忽略各個組分的響應因子或者默認為每個組分的響應因子相同，計算如下式：峰面積百分比法適合于不需要準確定量，同時難以得到響應因子的情況。標準加入法標準加入法實質上是一種特殊的內(nèi)標法，是以待測組分的純物質作為內(nèi)標，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入后待測組分的峰面積（或峰高），從而計算出樣品中待測組分的含量。以峰面積計算方法為例，標準加入法的計算如下：式中，Δwi為加入的標準品的量，Ai為待測組分的峰面積，ΔAi為加入標準品后待測組分峰面積的增加量，wi為原樣品中待測組分的含量。無論是何種定量計算方法都各有優(yōu)缺點，沒有一種方法是一勞永逸，還應該根據(jù)樣品情況，具體情況具體選擇。原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
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